The tärkein ero DNA: n ja RNA: n erottamisen välillä on, että pH -taso on DNA -uutto on pH 8, kun taas RNA -uuton pH -taso on pH 4,7. DNA pyrkii denaturoitumaan ja siirtymään orgaaniseen faasiin happamassa pH: ssa. Alkalisessa pH: ssa RNA käy läpi alkalisen hydrolyysin, koska riboosisokerissa on 2 'OH.

DNA- ja RNA -uutto ovat kaksi menettelyä, jotka liittyvät nukleiinihappojen eristämiseen ja puhdistamiseen kudossoluista. Molemmat toimenpiteet koostuvat kolmesta vaiheesta. Hyvälaatuisella DNA: lla ja RNA: lla on kriittinen rooli molekyylibiologiassa, biotekniikassa, genomiikassa ja epidemiologisissa kokeissa.

Keskeiset alueet

1. Mikä on DNA -uutto - Määritelmä, menettely 2. Mikä on RNA -uutto - Määritelmä, menettely 3. Mitkä ovat samankaltaisuudet DNA: n ja RNA: n erottamisen välillä? - Yleiskatsaus 4. Mitä eroa on DNA: n ja RNA: n erottamisen välillä? - Keskeisten erojen vertailu

Keskeiset termit: Solujen hajoaminen, proteiinien denaturointi, DNA -uutto, pH, saostus, RNA -uutto

Mikä on DNA -uuttaminen

DNA -uuttaminen on DNA: n eristämis- ja puhdistusmenetelmä. DNA voidaan eristää verestä, jäädytetyistä kudosnäytteistä tai parafiinikudoslohkoista. DNA: n uuttamisen kolme vaihetta ovat solujen hajoaminen, DNA: n eristäminen ja saostaminen. Solun hajoamisen aikana solukalvon esteet, kuten solukalvo ja ytimen kalvot, avautuvat paljastaakseen DNA: n. Seuraava vaihe on kalvon lipidien poistaminen näytteestä. Lopuksi DNA: n saostaminen sisältää DNA: han liittyvien proteiinien poistamisen proteaasilla ja RNA: n poistamisen RNaasilla.

Kuva 1: DNA -uutto

DNA: n erottamisen perusprotokollat

Alla on esitetty DNA: n erottamisen perusprotokollat.

1. Solujen hajoaminen solulyysipuskurilla solukalvojen hajotamiseksi

2. Lipidit hajotetaan pesuaineilla ja pinta -aktiivisilla aineilla

3. Proteiinien pilkkominen lisäämällä proteaasia

4. RNA: n pilkkominen lisäämällä RNaasia

5. Solujätteiden, pilkottujen proteiinien, lipidien ja RNA: n erottaminen lisäämällä väkevää suolaa ja sentrifugoimalla

6. DNA: n saostaminen etanolilla jääkylmällä etanolilla tai isopropanolilla. Natriumasetaatin ionivahvuutta voidaan käyttää saostumisen parantamiseen. Saostunut DNA näkyy lankoina lopullisessa liuoksessa.

Kuva 2: Uutettu DNA

Fenoli-kloroformiuuttoa voidaan käyttää myös erottamaan DNA proteiineista. Tässä fenoli denaturoi näytteen proteiinit ja DNA pysyy vesifaasissa uuton lopussa. Ja orgaanisessa vaiheessa löydät denaturoituja proteiineja. Toinen menetelmä DNA: n erottamiseksi on minipylväspuhdistus. Tässä DNA: n sitoutuminen pylvääseen riippuu puskurin pH: sta ja suolapitoisuudesta.

Mikä on RNA -uuttaminen

RNA -uutto viittaa prosessiin RNA: n puhdistamiseksi näytteistä. Perinteistä RNA: n uuttomenetelmää kutsutaan guanidiniumtiosyanaatti-fenoli-kloroformiuutto. Guanidiniumtiosyanaatti denaturoi proteiinit. Lisäksi se katkaisee vesimolekyylien vetysidoksen ja toimii kaotrooppisena aineena. RNA -uutossa käytetään erityistä reagenssia nimeltä Tri-reagenssi. Se sisältää guanidiniumtiosyanaattia, fenolia ja natriumasetaattia. RNA: n erottamisen perusvaiheiden tarkoitus on samanlainen kuin DNA: n uuttamisen. RNA -uuttokäytäntö on kuvattu alla.

1. Solut pestään jääkylmällä PBS: llä solujen osmolaarisuuden ylläpitämiseksi.

2. Imu solut ja homogenoi näyte Tri-reagenssilla.

3. Lisää kloroformia ja ravista.

4. Sentrifugointi voi johtaa kolmeen kerrokseen. Yläkerros on vesikerros, joka on kirkas. Keskikerros tai välivaihe sisältää saostuneen DNA: n. Alempi kerros on orgaaninen kerros, joka on vaaleanpunainen.

5. Poista vesikerros ja lisää isopropanolia. Sentrifugointi voi johtaa pellettiin.

6. Pese pelletti 75 -prosenttisella etanolilla. Kuivaa pelletti ilmalla.

7. Liuota pelletti TE -puskurilla tai vedellä.

Kuva 3: RNA: n fenoli-kloroformiuutto

RNA -uutto suoritetaan yleensä pH: ssa alle 7. Alkalisessa pH -arvossa RNA hajoaa enemmän alkalisella hydrolyysillä johtuen OH -ryhmän läsnäolosta riboosisokerin 2' -asemassa. Lisäksi RNA pyrkii pysymään vesifaasissa happamassa pH: ssa. Toisaalta DNA pyrkii denaturoitumaan ja siirtymään orgaaniseen faasiin happamassa pH: ssa. Siksi DNA -uutto voidaan suorittaa noin pH: ssa 8. DNA koostuu deoksiriboosisokerista, eikä se käy läpi alkalista hydrolyysiä.

DNA: n ja RNA: n erottamisen väliset yhtäläisyydet

Ero DNA: n ja RNA: n erottamisen välillä

Määritelmä

DNA -uutto: DNA: n eristäminen ja puhdistus

RNA -uutto: Prosessi RNA: n puhdistamiseksi näytteistä

Uutetun nukleiinihapon tyyppi

DNA -uutto: DNA

RNA -uutto: RNA

pH

DNA -uutto: Tehty klo 8

RNA -uutto: Tehty 4.7

Askeleet

DNA -uutto: Solukalvojen rikkominen tai solujen hajoaminen, kalvon lipidien poistaminen ja DNA: n saostaminen

RNA -uutto: Solujen hajoaminen, guanidiniumtiosyanaatti-fenoli-kloroformiuutus, valmistus isopropanolilla

DEPC-käsitellyn veden käyttö

DNA -uutto: Ei mitään

RNA -uutto: Kaikki reagenssit valmistetaan DEPC-käsitellyllä vedellä

Varastointi

DNA -uutto: DNA voidaan uuttaa ennen ja varastoida erissä

RNA -uutto: RNA -uutto tehdään juuri ennen jatkokäytäntöjä

Pitkäaikaissäilytys

DNA -uutto: -20 ° C: ssa

RNA -uutto: -80 ° C: ssa

Johtopäätös

DNA -uutto suoritetaan pH: ssa 8. DNA pyrkii siirtymään orgaaniseen faasiin, kun se denaturoi happamassa pH: ssa. Mutta RNA -uutto suoritetaan alhaisessa pH: ssa, jotta estetään hajoaminen alkalisen hydrolyysin vuoksi. Sekä DNA: n että RNA: n erottamisen vaiheiden perimmäinen tarkoitus on samanlainen. Suurin ero DNA: n ja RNA: n uuton välillä on kussakin uuttotyypissä käytetyt pH -olosuhteet.

Viite:

1. "DNA: n erottamisen perusteet". Alaska BioPREP Virtual Textbook, Alaska BioPREP University of Alaska Fairbanks, saatavana täältä2. "RNA -eristämis- ja käänteistranskriptioprotokolla: solut viljelmässä." abcam, saatavana täältä

Kuva:

1. “Kuva 17 01 02” CNX OpenStax-(CC BY 4.0) Commons Wikimedian kautta 2. “DNA Extraction” Joo Nath-Oma työ (CC BY-SA 4.0) Commons Wikimedian kautta 3. “PhOH-CHCl3-uutto” Kirjoittanut Squidonius (keskustelu)-Oma työ (Alkuperäinen teksti: itse tehty) (Public Domain) Commons Wikimedian kautta