The tärkein ero välillä Maxam Gilbert ja Sanger sekvensointi on, että Maxam-Gilbert-sekvensointi on kemiallinen DNA-sekvensointimenetelmä, joka perustuu DNA: n nukleobasispesifiseen osittaiseen kemialliseen modifiointiin ja sen jälkeiseen DNA-rungon pilkkomiseen modifioitujen nukleotidien vieressä. Mutta toisaalta Sangerin sekvensointi on ketjun päättämismenetelmä, joka keskeyttää DNA -sekvenssien pidentymisen sisällyttämällä dideoksinukleotideja sekvensseihin. Lisäksi Maxam Gilbertin sekvensointi käyttää suurta määrää vaarallisia kemikaaleja, mukaan lukien radioaktiivinen materiaali ja hydratsiini. Sangerin sekvensointi käyttää kuitenkin vähemmän vaarallisia kemikaaleja.

Maxam Gilbertin ja Sangerin sekvensointi ovat kaksi perinteistä DNA-sekvensointimenetelmää, jotka kehitettiin 1970-luvun puolivälissä. Yleensä he ovat vastuussa nukleotidiemästen määrittämisestä DNA -molekyylissä.

Perinteiset menetelmät, DNA -sekvensointi, Maxam Gilbert -järjestys, Sanger -sekvensointi

Mikä on Maxam Gilbertin sekvensointi

Maxam Gilbertin sekvensointi on yksi kahdesta tavanomaisesta Allan Maxamin ja Walter Gilbertin vuosina 1977–1980 kehittämästä DNA -sekvensointimenetelmästä. Se tunnetaan myös kemiallisena DNA -sekvensointimenetelmänä.

Yleiskatsaus

Pohjimmiltaan tämä menetelmä sisältää DNA -molekyylien terminaalisen merkitsemisen kemiallisilla aineilla, mitä seuraa DNA -emästen muuttaminen neljässä erilaisessa kemiallisessa reaktiossa. Tämän jälkeen DNA pilkotaan modifioitujen A + G-, G-, C + T- ja C -emästen kiinnittymiskohdassa. Tämän jälkeen syntetisoidaan radioaktiivisia fragmentteja, jotka ulottuvat leimatusta päästä nukleotidiemäksen asemaan. Lopulta PAGE erottaa murtumispisteen tuottamalla neljä erilaista katkaisukuviota kullekin neljästä DNA -emäksestä.

Kemia

Maxam Gilbertin sekvensoinnin vaiheet ovat:

1. 5'-pään radioaktiivinen leimaus kinaasireaktiolla käyttäen gamma-32P ATP: tä ja puhdistusta
2. Neljä kemiallista käsittelyä A+ G-, G-, C+ T- ja C -emäksille (puriinien (A+ G) puhdistaminen muurahaishapolla, guaniinin (G) metylointi dimetyylisulfaatilla, pyrimidiinien (C+ T) hydrolysointi hydratsiinilla ja Tymiinin hydratsiinireaktion esto lisäämällä natriumkloridia, hydrolysoimalla vain sytosiini (C)
3. Muunnetun DNA: n pilkkominen kuumalla piperidiinillä; (CH2) 5NH modifioidun emäksen asemassa, mikä tuottaa sarjan leimattuja fragmentteja radioleimatusta päästä ensimmäiseen "leikkauskohtaan".
4. Fragmenttien kokofraktiointi PAGE: lla (polyakryyliamidigeelielektroforeesi).
5. Visualisointi autoradiografialla, päätellen sekvenssin.

   

   Kuva 1: Maxam Gilbertin sekvensointi

Merkitys

Periaatteessa Maxam Gilbertin sekvensoinnin kaksi tärkeintä ominaisuutta on se, että se on sekä herkkä että spesifinen. Siksi se voi tarjota hyvän eron emästen välillä. Silti kestää muutaman päivän analysoida 200-300 emäksen sekvenssi. Toisaalta se käyttää sekä radioaktiivisia elementtejä että hydratsiinia, joka on neurotoksiini.

Mikä on Sangerin sekvensointi

Sangerin sekvensointi on toinen tavanomainen DNA -sekvensointimenetelmä, jonka Frederick Sanger ja hänen kollegansa kehittivät vuonna 1977. Merkittävää on, että Applied Biosystems kaupallisteli sen.

Yleiskatsaus

Yleensä Sangerin sekvensointi tunnetaan myös ketjun päättämismenetelmänä, joka perustuu ketjun päättävien dideoksinukleotidien (ddNTP: t) sisällyttämiseen DNA-polymeraasin in vitro replikaation kautta. Merkittävää on, että ddNTP: stä puuttuu 3′-OH-ryhmä, joka on vastuussa fosfodiesterisidoksen muodostumisesta tulevan nukleotidin kanssa, jolloin DNA-polymeraasi lopettaa DNA: n laajentumisen modifioidun ddNTP: n sisällyttämisen kanssa. Lisäksi nämä ddNTP: t on merkitty joko radioaktiivisesti tai fluoresoivasti, mikä mahdollistaa emäksen havaitsemisen.

Kemia

Sangerin sekvensoinnin vaiheet ovat:

1. DNA -näytteen jakaminen neljään erilliseen sekvensointireaktioon ddATP: n, ddCTP: n, ddGTP: n ja ddTTP: n kanssa.
2. Fluoresoiva merkintä (ddATP vihreällä, ddCTP sinisellä, ddGTP keltaisella ja ddTTP punaisella)
3. Erillisten PCR -reaktioiden suorittaminen vastaavan ddNTP: n kanssa. Tässä dideoksinukleotidipitoisuuden tulisi olla noin 100 kertaa pienempi kuin vastaavan deoksinukleotidin.
4. Amplikonien lämmön denaturointi ja erottaminen denaturoivassa polyakryyliamidi-urea-geelissä. Neljä reaktiota suoritetaan yhdellä neljästä yksittäisestä kaistasta (kaistat A, T, G, C).
5. Visualisointi ja DNA -sekvenssin määrittäminen.

   

   Kuva 2: Sangerin sekvensointi

Merkitys

Merkittävää on, että Sangerin sekvensointi on suuresti yksinkertaistettu DNA -sekvensointimenetelmä. Siksi menetelmän tulo vauhditti DNA: n sekvensointia, mikä mahdollisti nopeamman sekvenssitietojen keräämisen eri geeneille ja organismeille. Se ei kuitenkaan käytä monia vaarallisia kemikaaleja prosessissa. Silti Sangerin sekvensointimenetelmän herkkyys on suhteellisen alhainen.

Yhtäläisyyksiä Maxam Gilbertin ja Sangerin sekvensoinnin välillä

Ero Maxam Gilbertin ja Sangerin sekvensoinnin välillä

Määritelmä

Maxam Gilbertin sekvensointi viittaa DNA -sekvensointimenetelmään, joka perustuu nukleotidispesifiseen osittaiseen kemialliseen modifikaatioon ja sitä seuraavaan DNA: n katkaisuun. Sitä vastoin Sangerin sekvensointi viittaa ketjun päättävien dideoksinukleotidien valikoivaan sisällyttämisprosessiin DNA-polymeraasin avulla in vitro DNA-replikaation aikana.

Kehittäjä

Maxam Gilbertin sekvensoinnin ovat kehittäneet Allan Maxam ja Walter Gilbert vuosina 1977–1980, kun taas Sangerin sekvensoinnin ovat kehittäneet Frederick Sanger ja hänen kollegansa vuonna 1977.

Tunnetaan

Maxam Gilbertin sekvensointi on sekvensoinnin kemiallinen menetelmä, kun taas Sangerin sekvensointi on ketjun päättämismenetelmä.

Kemikaalit

Maxam Gilbertin sekvensointi käyttää suurta määrää vaarallisia kemikaaleja, mukaan lukien radioaktiivinen materiaali ja hydratsiini, kun taas Sangerin sekvensointi käyttää vähemmän vaarallisia kemikaaleja.

Herkkyys ja spesifisyys

Maxam Gilbertin sekvensointi on erittäin herkkä ja erittäin spesifinen, kun taas Sangerin sekvensointi on vähemmän herkkä ja vähemmän spesifinen.

Johtopäätös

Maxam Gilbertin sekvensointi on yksi kahdesta tavanomaisesta DNA -sekvensointimenetelmästä. Yleensä se käyttää erilaisia ​​kemikaaleja DNA -juosteen nukleotidiemästen spesifiseen modifiointiin. Lopulta DNA: n katkaisu modifioiduissa kohdissa mahdollistaa emästen määrittämisen. Merkittävää on, että tämä menetelmä on herkempi ja spesifisempi. Se käyttää kuitenkin vaarallisia kemikaaleja. Sitä vastoin Sangerin sekvensointi on toinen tavanomainen DNA -sekvensointimenetelmä, jota käytetään laajalti. Yleensä se käyttää leimattuja ddNTP: itä katkaisemaan ketjun kasvu DNA: n replikaation aikana kussakin neljässä nukleotidissa. Lopuksi päätettyjen amplikonien erottaminen geelillä mahdollistaa DNA -sekvenssin määrittämisen. Tämä menetelmä on kuitenkin vähemmän spesifinen ja vähemmän herkkä ensimmäiseen menetelmään nähden. Silti se käyttää vähemmän vaarallisia kemikaaleja. Siksi suurin ero Maxam Gilbertin ja Sangerin sekvensoinnin välillä on menetelmä ja tärkeys.

Viitteet:

1. "DNA -sekvensointi". Integroitu DNA -tekniikka. Saatavana täältä.

Kuva:

1. “Maxam-Gilbert-sekvensointi en” Incnis Mrsi. Alkuperäinen löytyy täältä: Maxam-Gilbert sequencing.svg. (CC BY-SA 3.0) Commons Wikimedian kautta 2. "Sanger-sekvensointi" Estevezj-Oma työ (CC BY-SA 3.0) Commons Wikimedian kautta