Taq -polymeraasi on entsyymi, jota käytetään polymeraasiketjureaktiossa (PCR) DNA: n syntetisoimiseksi in vitro. Se on analoginen E. coli DNA -polymeraasi 1: n kanssa. Se kestää korkeita lämpötiloja, joita käytetään PCR: ssä, säilyttäen entsymaattisen aktiivisuutensa. Taq -polymeraasia löytyy luonnollisesti termofiilisestä bakteerista, joka tunnetaan nimellä Thermus aquaticus. Bakteeri elää erittäin kuumissa ympäristöissä, kuten hydrotermisissä tuuletusaukoissa ja kuumissa lähteissä. Siksi se on erittäin lämpöstabiili. Optimaalinen lämpötila Taq-polymeraasin aktiivisuudelle on 75-80 ° C.

Keskeiset alueet

1. Mikä on Taq -polymeraasi - Määritelmä, sijainti, ominaisuudet 2. Miksi Taq -polymeraasi on lämpöstabiili - Thermus Aquaticuksen termofiilinen luonne 3. Mikä on Taq -polymeraasin rooli PCR: ssä - Taq -polymeraasin käyttö PCR: ssä

Avaintermit: DNA -polymeraasi 1, PCR, Taq -polymeraasi, termofiiliset bakteerit, Thermus aquaticus

Mikä on Taq -polymeraasi

Taq -polymeraasi on kaupallisesti saatavilla oleva, lämpöstabiili DNA -polymeraasi, jota käytetään PCR: ssä DNA: n syntetisoimiseksi. Se on peräisin Thermus aquaticus -nimisestä eubakteerista. Bakteerin luonnollinen elinympäristö on kuumia lähteitä, joiden ympäristölämpötila on 70-75 ° C. Taq -polymeraasin rakenne on esitetty kuvassa 1.

Kuva 1: Taq -polymeraasi

Taq-polymeraasi on 94 kD: n DNA-riippuvainen DNA-polymeraasi, joka on homologinen E. colin DNA-polymeraasi 1: n kanssa. Siten Taq -polymeraasi koostuu 3' -OH -nukleotidilisäyskohdasta, dNTP/DNA -sitoutumiskohdasta ja 5' -3' -eksonukleaasikohdasta. Siitä puuttuu kuitenkin 3 ' - 5' eksonukleaasidomeeni saapuvien nukleotidien oikolukemista varten.

Miksi Taq -polymeraasi on lämpöstabiili

Taq -polymeraasin luonnossa esiintyvä bakteeri on termofiilinen. Se asuu ympäristössä, jossa on äärimmäisiä lämpötiloja, kuten hydrotermiset tuuletusaukot ja kuumat lähteet. Thermus aquaticus on eristetty Yellowstonen kansallispuiston poreilevista kuumista lähteistä Yhdysvalloissa. Koska Thermus aquaticus on mukautettu elämään äärimmäisissä lämpötiloissa, bakteerista eristetty Taq -polymeraasi kestää myös korkeampia lämpötiloja. Yellowstonen kansallispuiston kuumia lähteitä on esitetty kuvassa 2.

Kuva 2: Grand Prismatic Spring Yellowstonen kansallispuistossa

Mikä on Taq -polymeraasin rooli PCR: ssä

DNA-riippuvaisen DNA-polymeraasi 1: n Klenow-fragmenttia käytettiin ensin PCR: ssä, joka ei ole lämmönkestävä. Siitä puuttui kuitenkin 5 ' - 3' eksonukleaasiaktiivisuus. Klenow -fragmentin optimaalinen lämpötila on 37 ° C. Siksi reaktioon oli lisättävä uusi entsyymi jokaista sykliä kohden. Jäljellä oleva Klenow -fragmentti denaturoitiin 95 ° C: ssa tapahtuvan PCR: n denaturointivaiheen aikana. Lisäksi Klenow -fragmentti pystyi syntetisoimaan vain alle 400 emäsparin fragmentteja. PCR -vaiheet on esitetty kuvassa 3.

Kuva 3: PCR 1 - denaturointi 95 ° C: ssa, 2 - hehkutus 68 ° C: ssa, 3 - venymä 72 ° C: ssa, 4 - syklin päättyminen

Sillä välin, vuonna 1966, Thomas D.Brock löysi termofiilin, Thermus aquaticuksen, Yhdysvaltain Yellowstonen kansallispuiston kuumista lähteistä. Tämän jälkeen PCR -menetelmässä käytettiin Thermus aquaticuksesta uutettua Taq -polymeraasia. Taq -polymeraasia käytetään alukkeiden pidentämiseen lisäämällä nukleotideja templaattiin PCR: n aikana. PCR: n aikana reagenssit kuumennetaan 95 ° C: seen. Normaali DNA -polymeraasi denaturoi tämä korkea lämpötila. Taq-polymeraasin optimaalinen lämpötila on kuitenkin 75-80 ° C. Lisäksi Taq -polymeraasin virhetaso on noin yksi miljoonasta emäsparista. Pfu on toinen termostabiilin DNA -polymeraasin tyyppi, jota käytetään Taq -polymeraasin sijasta PCR: ssä. Sillä on oikolukutaito. Siksi se on tarkempi kuin Taq -polymeraasi.

Viite:

1. "Taq ja muut lämpöstabiilit DNA -polymeraasit." SpringerLink, Springer, Dordrecht, 1. tammikuuta 1970, saatavana täältä.

Kuva:

1. "Taq", Adenosine-Oma työ (CC BY-SA 3.0) Commons Wikimedian kautta 2. "Grand Prismatic Spring, Yellowstonen kansallispuisto (3646969937)" Frank Kovalchek, USA-Grand Prismatic Spring, Yellowstonen kansallispuisto (CC BY 2.0) Commons Wikimedian kautta 3. ”Pcr” Magnus Manske (CC BY-SA 3.0) Commons Wikimedian kautta