Tärkein ero-PCR vs RT-PCR

PCR ja RT-PCR ovat kaksi tärkeää tekniikkaa molekyylibiologiassa. PCR: n kehitti Kary Mullis 1980 -luvulla. Se pystyy lisäämään tietyn geenin kopioiden määrää eksponentiaalisesti, mikä helpottaa kyseisen DNA -fragmentin havaitsemista. Taq -polymeraasi on eniten entsyymi, jota käytetään PCR -järjestelmissä. Se on lämpöstabiili entsyymi. RT-PCR: ssä käänteistranskriptiota seuraa PCR. Entsyymi, käänteistranskriptaasi, osallistuu komplementaarisen DNA: n synteesiin RNA: sta. The tärkein ero PCR: n ja RT-PCR: n välillä on se PCR käyttää kaksijuosteista DNA: ta templaattina, kun taas RT-PCR käyttää RNA: ta templaattina.

Keskeiset alueet

1. Mikä on PCR - Määritelmä, prosessi, sovellus 2. Mikä on RT PCR - Määritelmä, ominaisuudet, sovellus 3. Mitä eroa on PCR: llä ja RT PCR: llä? - Keskeisten erojen vertailu

Keskeiset termit: PCR, RT-PCR, polymeraasiketjureaktio, käänteiskopiointi-polymeraasiketjureaktio, DNA-malli, DNA-polymeraasi, denaturointi, hehkutus, alukkeen pidennys

Mikä on PCR

PCR (Polymeraasiketjureaktio) on suhteellisen yksinkertainen mutta mullistava menetelmä. PCR käyttää entsyymin, DNA -polymeraasin kykyä syntetisoida uusia DNA -juosteita täydentävällä tavalla tarjotun templaattiketjun kanssa. PCR on välttämätön tekniikka, jota käytetään sekä kliinisissä että tutkimuslaboratorioissa geenien toiminnalliseen analysointiin, diagnosointiin ja perinnöllisten sairauksien seurantaan, DNA -kloonaukseen, sekvensointiin ja muinaisen DNA: n monistamiseen. DNA -templaatti, nukleotidit, alukkeet ja DNA -polymeraasi ovat PCR: n neljä pääkomponenttia. The DNA -malli on yleensä kaksijuosteinen DNA, jossa on kohdesekvenssi, joka on tarkoitus monistaa. Taq -DNA -polymeraasi joka on eristetty Thermus -vedestä, käytetään yleisesti PCR: ssä. The Pfu -DNA -polymeraasi on toisen tyyppinen DNA -polymeraasi, jolla on suuri tarkkuus. Sekä Taq- että Pfu -polymeraasit ovat lämmönkestäviä. DNA -polymeraasien lisäämät nukleotidit ovat adeniini (A), guaniini (G), sytosiini (C) ja tymiini (T). Koska DNA-polymeraasi voi lisätä uuden nukleotidin vain olemassa olevan DNA-juosteen 3'-päähän, tarvitaan oligonukleotidialuke DNA-synteesin aloittamiseksi. Alukkeen vaatimus PCR: ssä mahdollistaa vain tietyn alueen määrittelyn mallissa. Kohdesekvenssiä reunustavat eteenpäin- ja käänteisalukkeet. PCR: n lopussa uusia kopioita, joita kutsutaan tietyn DNA -sekvenssin amplikoneiksi, kerätään miljardeja. PCR: n komponentit tulisi optimoida siten, että PCR -suorituskyky paranee ja vika minimoidaan.

PCR on automatisoitu prosessi, jonka suorittavat lämpösyklit, jotka pystyvät vaihtamaan eri lämpötilojen välillä. PCR on kolmivaiheinen prosessi.

1. Denaturointi -Kaksijuosteinen DNA-templaatti erotetaan kahdeksi yksijuosteiseksi kuumentamalla 94-95 ° C: seen.
2. Hehkutus - eteenpäin- ja käänteisalukkeet sitoutuvat templaatin komplementaarisiin sekvensseihin. Tämän vaiheen lämpötila riippuu alukeyhdistelmän sulamislämpötilasta.
3. Primer -jatke - DNA -polymeraasientsyymi laajentaa jokaista aluketta niiden 3' -päähän lisäämällä komplementaarisia emäksiä kasvavaan juosteeseen. Taq -polymeraasin optimaalista lämpötilaa, 72 ° C, käytetään lämpötilassa jatkevaiheessa. Laajentumisaika riippuu emäsparien lukumäärästä malliketjussa.

Kolme vaihetta toistetaan 28-35 kertaa.

Kuva 1: Polymeraasiketjureaktio

PCR -tuotteet fraktioidaan koon mukaan agaroosigeelielektroforeesilla verrattuna DNA -tikkaisiin. DNA: n visualisointi agaroosigeelillä tehdään värjäämällä etidiumbromidilla ja tarkkailemalla UV -valossa. Monistetut DNA-vyöhykkeet UV-säteilyssä etidiumbromidivärjättyssä geelissä on esitetty kuvassa 2. DNA-tikkaat on esitetty vasemmassa kuopassa.

Kuva 2: DNA -kaistat

Mikä on RT-PCR

RT-PCR (Käänteinen transkriptio-polymeraasiketjureaktio) on yksi herkimmistä tekniikoista, joita käytetään mRNA: n havaitsemiseen. RNA on sopiva malli tiedon keräämiseksi joko normaalin kudoksen geeniekspressiosta tai tartunnan saaneen kudoksen geeniekspressiosta. RT-PCR: n templaatti voi olla joko kokonais-RNA tai vastaavasti virus- tai bakteeri-RNA. RNA käänteiskopioidaan komplementaariseksi DNA: ksi (cDNA) entsyymin, käänteistranskriptaasin, avulla. Käänteiskopioijaentsyymin optimaalinen lämpötila on 46 ° C. CDNA: ta käytetään PCR: ssä tuotteen saamiseksi. Käänteisen transkription PCR: n vaiheet on esitetty kuvassa 3.

Kuva 3: RT-PCR

RT-PCR voidaan suorittaa kaksivaiheisina tai yksivaiheisina reaktioina. Kaksivaiheisessa reaktiossa käänteistranskriptio ja PCR suoritetaan kahdessa erillisessä vaiheessa. Yksivaiheisessa RT-PCR: ssä käänteistranskriptiota seuraa PCR yhdessä putkessa peräkkäin. Sekä cDNA että lopullinen PCR -tuote voidaan ajaa agaroosigeelillä koon fraktiointia ja visualisointia varten. Yksivaiheinen ja kaksivaiheinen RT-PCR on esitetty kuvassa 4.

Kuva 4: Yksi- ja kaksivaiheinen RT-PCR

Ero PCR: n ja RT-PCR: n välillä

Määritelmä

PCR: PCR on tekniikka, jota käytetään molekyylibiologiassa monistamaan DNA -segmentti, joka tuottaa miljoonia kopioita DNA -sekvenssistä.

RT-PCR: RT-PCR on PCR-muunnos, jota käytetään geeniekspression havaitsemiseen molekyylibiologiassa.

Askeleet

PCR: Denaturointi, hehkutus ja pidennys ovat PCR: n kolme vaihetta.

RT-PCR: RT-PCR: ssä käänteistranskriptiota seuraa PCR.

Sapluuna

PCR: Kaksijuosteinen DNA-molekyyli toimii templaattina PCR: lle.

RT-PCR: Yksijuosteinen RNA-molekyyli toimii templaattina käänteistranskriptiolle. Yksijuosteinen DNA-molekyyli toimii templaattina PCR: lle.

Käytetyt entsyymit

PCR: DNA -polymeraasia käytetään entsyyminä PCR: ssä.

RT-PCR: Käänteistä transkriptaasia ja DNA-polymeraasia käytetään entsyymeinä RT-PCR: ssä.

Alukkeet

PCR: PCR: ssä käytetään eteenpäin- ja käänteisalukkeita.

RT-PCR: Käänteistranskriptioon käytetään vain käänteisaluketta ja PCR: ssä käytetään sekä eteen- että käänteisalukkeita.

Herkkyys

PCR: PCR on herkkä menetelmä.

RT-PCR: RT-PCR on herkempi kuin PCR.

Sovellukset

PCR: PCR: ää käytetään geenien toiminnallisessa analyysissä, perinnöllisten sairauksien diagnosoinnissa ja seurannassa, DNA -kloonauksessa, DNA -sekvensoinnissa ja muinaisen DNA -monistuksessa.

RT-PCR: RT-PCR: ää käytetään geeniekspression havaitsemiseen.

Johtopäätös

PCR ja RT-PCR ovat kaksi tärkeää molekyylibiologiassa käytettyä tekniikkaa. Sekä PCR että RT-PCR ovat automatisoituja tekniikoita, jotka kykenevät lisäämään eksponentiaalisesti kohde-DNA-sekvenssin kopioiden määrää, joka määritetään eteenpäin- ja käänteisalukkeilla. PCR: ssä käytetään kaksijuosteista DNA: ta templaattina. PCR: llä voidaan tehdä DNA -kloonaus, DNA -sekvensointi ja geenien toiminnallinen analyysi. RT-PCR: ssä geeniekspressio tietyssä kudoksessa voidaan havaita monistamalla RNA: ta. Suurin ero PCR: n ja RT-PCR: n välillä on niiden malleissa, joita käytetään kussakin reaktiossa ja niiden sovelluksissa.

Viite:

1. "Polymeraasiketjureaktio (PCR)." Kansallinen bioteknologian tiedotuskeskus. US National Library of Medicine, n.d. Web. Saatavana täältä. 1. kesäkuuta 2017. 2. ”Polymeraasiketjureaktio (tai PCR).” Geenien kloonaus ja molekyylianalyysi. N.p., n.d. Web. Saatavana täältä. 1. kesäkuuta 2017. 3. Biolabs, New England. "CDNA-synteesi ja RT-PCR." CDNA-synteesi ja RT-PCR | NEB. N.p., n.d. Web. Saatavana täältä. 01 kesäkuuta 2017.

Kuva:

1. ”Polymeraasiketjureaktio” Enzoklopilta-Oma työ (CC BY-SA 3.0) Commons Wikimedian kautta 2. “DNA fragmendid etiidiumbromiidiga värvitud agaroosgeelis.” Rainis Venta-Oma työ (CC BY-SA 3.0) Commons Wikimedia 3: n kautta. ”Käänteiskopiointipolymeraasiketjureaktio” Tekijä Jpark623-Oma työ (CC BY-SA 3.0) Commons Wikimedia 4: n kautta. RT-PCR ”Tekijä Jpark623-Oma työ (CC BY-SA 3.0) Commons Wikimedian kautta