Tärkein ero - PCR vs QPCR

PCR (polymeraasiketjureaktio) ja qPCR (kvantitatiivinen PCR) ovat kaksi tekniikkaa, joita käytetään biotekniikassa monistamaan DNA: ta eri tarkoituksiin. PCR on suhteellisen yksinkertainen tekniikka. qPCR tunnetaan myös nimellä reaaliaikainen PCR tai digitaalinen PCR. The tärkein ero PCR: n ja qPCR: n välillä on se PCR on kvalitatiivinen tekniikka, kun taas qPCR on kvantitatiivinen tekniikka. PCR mahdollistaa tuloksen lukemisen "läsnäolona tai poissaolona". Mutta qPCR: ssä kussakin syklissä monistetun DNA: n määrä kvantifioidaan. Jos RNA: ta käytetään PCR: ssä, tekniikka tunnetaan nimellä RT-PCR (käänteistranskription PCR), ja jos RNA: ta käytetään qPCR: ssä, tekniikka tunnetaan nimellä qRT-PC.

Keskeiset alueet

1. Mikä on PCR - Määritelmä, prosessit, käyttötavat 2. Mikä on QPCR - Määritelmä, prosessit, käyttötavat 3. Mitkä ovat PCR: n ja QPCR: n samankaltaisuudet? - Yleiskatsaus 4. Mitä eroa on PCR: n ja QPCR: n välillä? - Keskeisten erojen vertailu

Keskeiset termit: agaroosigeelielektroforeesi, amplikonit, DNA-polymeraasi, fluoresoiva väriaine, PCR, koettimet, qPCR, RT-qPCR

Mikä on PCR

PCR viittaa biotekniikan tekniikkaan, joka mahdollistaa lyhyen DNA -sekvenssin analysoinnin monistamalla valitun DNA -segmentin. Se on verrattain herkkä menetelmä, koska yksi reaktio vaatii hyvin pieniä tilavuuksia. Tekniikka perustuu DNA -polymeraasin kykyyn syntetisoida uusia DNA -juosteita tarjottuun templaattiketjuun täydentävällä tavalla. PCR -reaktioseos koostuu DNA -polymeraasista, DNA -nukleotideista, alukkeista, monistettavasta DNA -templaatista ja magnesiumista. Vahvistus suoritetaan lämpösyklin sisällä. DNA -polymeraasin tulisi olla kuumuutta kestävä, koska tässä reaktiossa käytetään korkeita lämpötiloja. PCR: ssä käytetyt kaksi DNA -polymeraasityyppiä ovat Taq -DNA -polymeraasi ja Pfu -DNA -polymeraasi. Taq -DNA -polymeraasia käytetään laajalti PCR: ssä.

DNA-polymeraasi vaatii jo olemassa olevan DNA-juosteen 3'-päässä uuden juosteen syntetisoimiseksi. Näin ollen oligonukleotidialuke lisätään reaktioseokseen DNA -synteesin aloittamiseksi. PCR: n alukkeen vaatimus sallii vain tietyn alueen vahvistamisen templaatissa. Kohdesekvenssiä reunustavat eteenpäin- ja käänteisalukkeet. PCR: n lopussa uudet kopiot tietystä DNA -sekvenssistä, joita kutsutaan amplikonit, kertyy miljardeja. PCR: n komponentit tulisi optimoida siten, että PCR -suorituskyky paranee ja vika minimoidaan. Standardi PCR -reaktio on esitetty kuvassa 1.

Kuva 1: PCR

PCR: n vaiheet

PCR: n kolme vaihetta kuvataan alla.

1. Denaturointi -Kaksijuosteinen DNA-templaatti erotetaan kahdeksi yksijuosteiseksi kuumentamalla 94-95 ° C: seen.
2. Hehkutus - Eteenpäin- ja käänteisalukkeet sitoutuvat templaatin komplementaarisiin sekvensseihin. Lämpötila riippuu pohjamaaliyhdistelmän sulamislämpötilasta.
3. Primer -jatke - DNA -polymeraasientsyymi laajentaa jokaisen alukkeen 3' -päähän lisäämällä komplementaarisia emäksiä kasvavaan juosteeseen. Taq -polymeraasin optimaalista lämpötilaa, eli 72 ° C, käytetään lämpötilassa jatkevaiheessa. Laajentumisaika riippuu emäsparien lukumäärästä malliketjussa.

Kolme vaihetta toistetaan 28-35 kertaa. Agaroosigeelielektroforeesia käytetään PCR -tuotteiden kokofraktioinnissa. Tuote värjätään etidiumbromidilla ja havaitaan UV -valossa. PCR -tuotetta tai monistettua DNA: ta voidaan käyttää kloonauksessa, sekvensoinnissa tai genotyypissä.

Mikä on QPCR

QPCR viittaa biotekniikan tekniikkaan, joka mahdollistaa nukleiinihappojen havaitsemisen, karakterisoinnin ja kvantifioinnin eri sovelluksiin. Siksi se on eräänlainen kvantitatiivinen PCR. Sekä DNA: ta että RNA: ta voidaan käyttää qPCR: nä. Jos RNA: ta käytetään templaattina, se tulisi ensin käänteiskopioida cDNA: ksi. Siten tämäntyyppinen qPCR tunnetaan nimellä RT-qPCR. Perinteinen PCR suoritetaan cDNA: lle tai tavalliselle DNA -näytteelle. Kuitenkin qPCR: ssä fluoresoivia väriaineita käytetään PCR -tuotteen merkitsemiseen jokaisessa PCR -syklin vaiheessa. Tämä mahdollistaa tietojen keräämisen PCR: n edetessä ja mahdollistaa amplikonien kvantifioinnin PCR: n eksponentiaalisen vaiheen aikana. Tärkein qPCR: ssä käytetty väriaine on SYBR Green. Väri sitoutuu kaksijuosteiseen DNA: han. Koska fluoresenssi kasvaa suhteessa monistetun DNA: n määrään, kvantifiointi voidaan tehdä ”reaaliajassa”. Väriaineen käytön suurin haittapuoli on se, että se mahdollistaa yhden tietyn tuotteen määrittämisen näytteessä. Väriaineiden lisäksi kvantifiointiprosessissa voidaan käyttää myös koettimia. TaqMan -koettimet ovat yksi qPCR: ssä käytettävien oligonukleotidikoettimien päätyypeistä, ja fluoresenssiemissioprosessi on esitetty kuvassa 2.

Kuva 2: TaqMan -anturi

Koettimet voidaan suunnitella siten, että ne voivat havaita useita PCR -tuotteita samassa näytteessä. TaqMan -koetin on yksi tärkeimmistä hydrolyysianturityypeistä; tämän koettimen sisällyttäminen PCR -tuotteeseen paljastaa fluoroforin, joka säteilee fluoresenssia. Fluoresoivat väriaineet ovat spesifisempiä PCR -tuotteelle. Siksi niitä käytetään useimmissa diagnostisissa määrityksissä PCR -tuotteen havaitsemiseksi.

PCR: n ja QPCR: n samankaltaisuudet

Ero PCR: n ja QPCR: n välillä

Määritelmä

PCR: PCR on biotekniikan tekniikka, joka mahdollistaa lyhyen DNA -sekvenssin analysoinnin monistamalla valitun DNA -segmentin.

QPCR: QPCR on biotekniikan tekniikka, joka mahdollistaa nukleiinihappojen havaitsemisen, karakterisoinnin ja kvantifioinnin eri sovelluksiin.

Määrällinen/laadullinen

PCR: PCR on kvalitatiivinen tekniikka.

QPCR: QPCR on kvantitatiivinen tekniikka.

Tuotteen havaitseminen

PCR: Tuote havaitaan agaroosigeelielektroforeesilla PCR: ssä.

QPCR: Tuote voidaan havaita jokaisessa qPCR -vahvistusjaksossa.

Tietojen kerääminen

PCR: Tiedot kerätään reaktion lopussa PCR: ssä.

QPCR: Tiedot kerätään reaktion eksponentiaalisen vaiheen aikana qPCR: ssä.

Resoluutio

PCR: PCR: n resoluutio on erittäin huono.

QPCR: QPCR: llä on erittäin korkea resoluutio.

Väriaineet

PCR: PCR käyttää etidiumbromidia tuotteen värjäämiseen PCR: n aikana.

QPCR: QPCR havaitsee tuotteen fluoresoivilla väreillä.

Aika

PCR: PCR on enemmän aikaa vievä menetelmä.

QPCR: QPCR on vähemmän aikaa vievä.

RNA

PCR: RT-PCR on PCR-tyyppi, joka käyttää RNA: ta mallina.

QPCR: RT-qPCR on qPCR-tyyppi, joka käyttää RNA: ta mallina.

Rooli

PCR: PCR: ää käytetään tiettyjen genomifragmenttien läsnäolon tai puuttumisen havaitsemiseen.

QPCR: QPCR: ää käytetään näytteen tietyn fragmentin kvantifioimiseen.

Johtopäätös

PCR ja qPCR ovat kahdenlaisia ​​tekniikoita, joita käytetään biotekniikassa monistamaan DNA: ta eri tarkoituksiin. PCR on perinteinen monistusmenetelmä, jota käytetään tunnistamaan DNA -fragmentin läsnäolo tai puuttuminen. QPCR: ää käytetään näytteen tietyn fragmentin kvantifioimiseen. Siten PCR on kvalitatiivinen tekniikka, kun taas qPCR on kvantitatiivinen tekniikka. Tämä on tärkein ero PCR: n ja qPCR: n välillä.

Viite:

1. "QPCR vs. digitaalinen PCR vs. perinteinen PCR." Thermo Fisher Scientific, saatavana täältä.

Kuva:

1. ”PCR” Madprimesta-Oma työ (CC BY-SA 3.0) Commons Wikimedia2: n kautta. “Taqman” Käyttäjä: Braindamaged - Alkuperäisen lataajan oma työ (Public Domain) Commons Wikimedian kautta